臺灣原生五加科植物應用與開發

臺灣原生五加科植物，如三葉五加、食用土當歸、裡白楤木、臺灣八角金盤等，除具獨特的芳香氣味而廣被利用為香料之外，在民俗療法中亦可常見被當成提神補氣的藥材，但到目前為止五加科植物在種源收集、成分分析以及活性探討等問題上，仍缺乏完整的資料。本計畫已收集10種台灣原生五加科植物枝條和葉部的乙醇萃取物並完成生物活性評估，包括抗氧化活性評估、抗發炎活性、細胞毒性和降尿酸活性等試驗。我們自食用土當歸的葉部抽出物中分離出一新化合物，經由MS、NMR、IR、UV等光譜分析以及Mosher酯化反應確認其絕對組態後，確定此新化合物結構為3(S),8(R)-pentadeca-1,9(Z)-diene-4,6-diyne-3,8-diol，並將其命名成Araliadiol。由細胞毒殺試驗證實Araliadiol具有顯著抑制人類乳癌細胞(MCF-7)生長的效果（IC₅₀＝6.41 μg/mL）。利用acridine orange染色觀察細胞自噬所形成之酸性小泡(AVO)，發現Araliadiol會誘導細胞產生自噬現象。而由細胞週期分析的觀察得知，經Araliadiol處理48小時後，細胞G₁周期的比例會隨著濃度的增加而增加，結果顯示Araliadiol能使MCF-7停滯在G₁期。以西方墨點法分析與細胞週期相關的蛋白表現量發現，Araliadiol會造成MCF-7的cyclin D₃ 和 cyclin-dependent kinase 4 (cdk4)的表現量降低，而p21 ^WAF-1/Cip1的表現量則會增加，且抑制 retinoblastoma protein (Rb) 的磷酸化，但磷酸化的p53 (Ser15)和Chk2則是沒有任何的改變。利用H₂D-CFDA測量細胞內的活性氧化物(ROS) ，發現Araliadiol會明顯增加細胞內的ROS。CuDIPS為一可展現類似超氧歧化酶(SOD)活性的化合物，MCF-7經CuDIPS預處理後則可減少因Araliadiol所造成的G₁停滯現象。綜合以上結果顯示，Araliadiol不是經由p53的途徑來增加p21 ^WAF-1/Cip1以及降低cyclin D₃和cdk4的表現，而是藉由 ROS 的產生來調控MCF-7細胞週期的進行，進而抑制了MCF-7的生長。 本研究鎖定三葉五加的倍半萜化合物生合成酶為目標，經由設計簡併性引子對，使用反轉錄聚合酶連鎖反應技術，自成熟之藤組織釣取到兩個具有典型萜類合成酶保守序列之基因，經過選殖，共獲得基因全長1671 bp (ATT9)及1593 bp (ATT9-1)，轉譯後蛋白質分子量約64.5 kDa及61.6 kDa，pI值為5.76及5.98。將此二基因分別構築於蛋白質表現之載體，轉入大腸桿菌 (Escherichia coli)表現，發現其中一蛋白質(ATT9)可催化倍半萜之前驅物FPP，使用氣相層析質譜儀(CG-MS)進行分析鑑定，確認ATT9為α-Copaene生合成酶。